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ELISA的實驗結(jié)果計算ELISA一步法實驗操作簡單，可在 90 分鐘獲得結(jié)果，既不影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性又能顯著提高分析性能，但實驗好做，結(jié)果計算常常難住不少同學(xué)，今天我們來一起分享下結(jié)果計算的方法。 作為ELISA的最后一步，檢測結(jié)果的計算對整個實驗十分重要。 以夾心法為例。 1.ELISA的樣本通常要設(shè)置1~2個復(fù)孔進行檢測，分別求出標(biāo)準(zhǔn)品、實驗組樣本的吸光度的平均值。單個樣本的檢測值不應(yīng)超出平均值的20%。 2.樣本的OD（吸光度）平均值要減去標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時的OD平均值。 3.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 在對數(shù)坐標(biāo)圖上擬合四參數(shù)的邏輯函數(shù)曲線（X軸上為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y軸為對應(yīng)的OD值）。推薦使用ELISACALC軟件。
詳細步驟如下： 第一步: 輸入 OD 值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度 此處選用的是百分率 logit 模型。 0輸入數(shù)據(jù)。這里中間的數(shù)據(jù)框中要輸入SO至S5的度與吸光值。注意，一定不能沒有SO。在左側(cè)“扣除本底”處可以輸入空白孔 (只加顯色液及終止液，) 的吸光值，如果沒有做，則就不用填了
第二步：“回/擬合模型”選擇“l(fā)ogit-log”方式。
第三步：點擊“回歸/擬合”顯示直線。
第四步：點“回歸方程”顯示參數(shù)，點“由Y計算 X”計算樣品與質(zhì)控濃度。在空格中輸入樣品或質(zhì)控的吸光值，回車或點擊“計算”。即能計算對應(yīng)的濃度。 一般情況按照說明書推薦方法擬合標(biāo)曲，可以用軟件繪制也可以手動制作。標(biāo)曲呈現(xiàn)s型曲線，兩端趨于水平，中間趨于線性，中間部分為較佳的檢測范圍。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的量超過與包被抗體結(jié)合的量，此時標(biāo)準(zhǔn)品已飽和，在增加標(biāo)準(zhǔn)品的量，其OD值不再變化，故當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品達到一定濃度后，曲線趨于水平。按照科學(xué)分析方法，如果存在奇異點或者污點，直接采用線性分析不理想，要對擬合曲線的幾個點進行取舍，同時可以改用雙對數(shù)直線擬合或者四參數(shù)曲線擬合。 此處選用的是“Logistic 曲線擬合2(四參數(shù)模型） 1)輸入數(shù)據(jù)。這里中間的數(shù)據(jù)框中要輸入標(biāo)準(zhǔn)品STAA至STAF的度(后面測出的結(jié)果的單位和此標(biāo)準(zhǔn)品單位一致)與吸光值。在左側(cè)“扣除本底”處可以輸入空白孔(只加顯色液及終止液，)的吸光值，如果沒有做，則就不用填了
2）“回/擬合模型”選擇“Logistic 曲線擬合2(四參數(shù))”方式
3)點擊“回歸/擬合”顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線
4)點“回歸方程”顯示參數(shù)(內(nèi)容可以直接復(fù)制)
5)點“由Y計算X”計算樣品濃度。在空格中輸入樣品的吸光值，回車或點擊“計算”即能計算對應(yīng)的濃度。(技巧:可以在表格中復(fù)制所有樣品的Y 值，在軟件中點擊“粘貼”按鈕，就可以得出所有的 X 值哦!全部計算完可以點擊“復(fù)制”按鈕將結(jié)果復(fù)制下來，粘貼到 EXCEL 表格里面)另:若數(shù)值超出曲線范圍，則有可能得不到結(jié)果，如下圖0.468的Y值所示。
切記，在實驗過程中，要根據(jù)各個實驗本身的特點，選擇最適合的曲線擬合模型，才能得到最合理的實驗結(jié)果，一般情況下，需要綜合考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線的趨勢走向以及R值的大小，來最終選擇適合自己的回歸方程。 |
